美国近700亿美元的生物燃料经济主要由两类技术路径支撑：其一是生化路线，利用微生物将植物生物质中的糖转化为酒精、其他生物燃料或化学品，美国每年约生产170亿加仑乙醇；其二是化学路线，通过催化剂将生物质和废料转化为类似目标产品。

美国能源部落基国家实验室（NLR）自20世纪80年代设立生物质项目以来持续推进相关研究。该实验室表示，仅自2020年以来已获得超过294项生物技术专利，并通过产业授权推动成果应用。

在上述两大“工具箱”之外，NLR近五年将研发重点之一放在第三条路径——“无细胞”生物制造（cell-free biomanufacturing）。该方法以酶作为生物催化剂，在不使用活细胞的条件下驱动反应链，将生物质衍生原料转化为特定化学品。

NLR首席科学家、无细胞生物制造研发负责人Yannick Bomble表示，无细胞生物制造的核心是在没有活细胞限制的情况下运行酶级联反应，相关技术可能影响生物能源领域，并可能延伸至制药和精细化工行业。NLR指出，相较依赖微生物的生产方式，无细胞体系对产品与原料的细胞毒性、产物运输、复杂代谢与竞争途径等因素的敏感性更低，反应过程可被更精细地控制。

高通量筛选与数据驱动的酶工程

在NLR的现场测试实验楼，研究人员使用液体处理机器人进行酶样品的高通量制备。研究员Hunter Harrington操作的系统可在不到一小时内准备超过1000种酶变体样品，用于快速筛选与表征。

研究人员Sam Mallinson介绍，团队通过监测代谢物在特定波长下的吸光信号变化来追踪反应过程。单日可获取数千个数据点，进而构建酶性能数据集，并借助人工智能在数分钟内从酶库中筛选出具有特定特性的候选者，再进入后续的手动测试与反应路径验证。

“外酶”体系与受控级联反应

NLR在《GEN Biotechnology》发表的研究描述了一类面向无细胞环境设计的酶（文中称为“外酶”）。在该体系中，十几种具有特定功能的酶被投入生物反应器，研究人员加入来自玉米秸秆、木屑等植物材料的糖，以及能量载体、水或溶剂。酶接触底物后依次催化反应：例如，一种酶结合糖释放中间体，另一种将酸转化为醛，随后反应级联继续推进。

NLR表示，这种做法可在很大程度上消除微生物“背景代谢”的干扰，使研究人员能够对反应步骤进行更直接的控制，以在特定时间点生成所需产物。

产业化面临的四项关键工程难题

尽管无细胞体系具备反应特异性强、速度快等特点，NLR认为要从实验室走向应用仍需解决多项工程与成本问题。Bomble指出，关键在于提升酶系统的产量与稳定性，并使整体成本对行业具有吸引力。

难题一：稳定且高效的酶系统设计

NLR正在识别适用于无细胞体系的酶特性并开发合成方法。实验室强调，工业化要求酶在溶剂环境中不易降解或失活，并能持续工作数天以覆盖制造成本；同时，各酶需具备可调性以支持高精度反应设计。

Bomble表示，若已知某反应所需酶但产量偏低，可能需要通过工程改造提升催化效率，而这通常意味着筛选数万种酶变体，高通量平台在此发挥作用。

NLR与工业合作伙伴eXoZymes Inc.合作发表的研究显示，热爱好酶因稳定性更高，运行时间可达温和环境细菌酶的六倍，萜类产量接近翻倍，并表现出更高的溶剂耐受性。Bomble称，这类产量水平在使用微生物底盘时较为少见，并希望从热爱好酶中提炼可迁移的设计原则，用于其他无细胞酶的改造。

难题二：廉价且通用的合成辅因子

无细胞体系除酶外还依赖辅因子等非蛋白分子以激活部分酶活性。NLR指出，尽管辅因子可在反应路径中循环使用，但以天然辅因子启动体系对大宗化学品生产而言成本较高。Bomble表示，辅因子可能是无细胞系统生产大宗化学品的最大成本驱动因素之一。

为此，NLR正构建具备稳定性、溶解性、经济性与兼容性（氧化还原电位）等特征的辅因子库，并与科罗拉多州立大学合作，利用人工智能与模型辅助设计预测。

在2025年发表于《Green Chemistry》的研究中，团队通过密度泛函理论与计算建模识别出132种可合成的烟酰胺辅因子；论文发表后，候选库已扩展至1000多种。Bomble表示，目标是在合成前更便捷地预测辅因子性能，以简化流程并提升工业规模可行性。

难题三：通用且低成本的酶固定化

NLR认为，将糖与多种酶直接混合并不足以支撑工业化：部分酶可能在数小时内失活，且自由漂浮的酶会增加产品回收难度。实验室正在开发更通用的固定化方法，以延长酶寿命、提升稳定性，并在回收产物时保留酶于反应器中。

Bomble表示，现有技术往往只能固定一两种酶，而要用同一方法固定15种以上酶难度很高。NLR的思路是借鉴热爱好细菌中的细胞纤维体（cellulosomes）结构，通过“dockerin—cohesin”式连接，将数十种酶特异性连接到可结合微粒的柔性蛋白“链”上，使企业可按需求调整无细胞系统。

NLR一项专利展示了该支架技术的适用性；近期发表于《Bioresource Technology》的论文则描述了其在2,3-丁二醇制造中的应用。Bomble称，该方法除额外蛋白的制造成本外无需额外费用，可在保持产量水平的同时获得稳定性与可重复使用优势。

难题四：结合酶与无机催化剂

为进一步提升效率，NLR还在探索将酶与无机催化剂置于同一反应器的混合体系。Bomble表示，无细胞体系与化学催化在同一反应器中更具兼容性，可在某些步骤引入能量以加速反应，并在特定场景下实现高于单独生物或化学方法的产量。

NLR指出，这一路径可能在部分应用中减少对氧化还原酶及辅因子的依赖；也可能帮助化工企业通过在化学催化中间体后增加一步酶反应，获得单靠化学或无细胞路径都较难实现的转化。

产业合作与商业化推进

NLR表示，无细胞生物制造的放大与商业化需要试点验证与产业协作。Bomble称，实验室已与科罗拉多大学、科罗拉多矿业学院、科罗拉多州立大学以及劳伦斯利弗莫尔国家实验室开展合作，并与eXoZymes Inc.进行多项联合研发。

通过NLR支持的壳牌GameChanger加速器，研究人员与eXoZymes（前身为Invizyne）合作改进无细胞系统中异丁醇的分离；双方还在美国能源部技术商业化基金项目框架下合作，展示无细胞生物制造中蛋白质生产与储存的规模化及成本可行性。

eXoZymes首席科学官兼联合创始人Tyler Korman表示，无细胞生物制造有潜力通过更高的控制力、速度与工艺灵活性拓展燃料、化学品与材料的生产方式，并称NLR在生物催化及工艺设计与建模方面的经验支持了相关项目推进与评估。