CRISPR作为可编程的DNA切割与编辑工具，近十年来推动了基因治疗、个性化肿瘤治疗及快速诊断等领域进展，但其离靶切割仍被视为影响安全性与有效性的关键问题。伦敦帝国理工学院医学科学研究委员会伦敦医学科学研究所（MRC LMS）与谢菲尔德大学研究人员在《自然》杂志发表论文称，DNA在细胞内的物理形态变化，尤其是扭曲与超螺旋状态，可能在离靶编辑中发挥重要作用。

研究团队指出，业界通常将CRISPR准确性问题归因于DNA序列识别，但在体内环境中，DNA在转录与复制过程中会持续发生弯曲、拉伸与扭转。其中一种常见构象为负超螺旋，即双螺旋略微解旋并通过形成环状结构缓解扭转应力。伦敦帝国理工学院分子与细胞生物物理学主席、MRC单分子成像组负责人David Rueda表示，离靶检测、重新设计引导序列以及由此带来的研发延误等成本，据估计每年在3亿至9亿美元之间。

为回答“Cas9如何与超螺旋DNA相互作用”的问题，研究人员开发了可人为引入超螺旋的纳米级DNA小环平台。论文称，该平台由博士生Quentin Smith在博士第一年设计，目标是在足够小、可用于冷冻电子显微镜成像的尺度下，同时保持DNA处于超螺旋状态。Smith表示，既往DNA小环尺寸偏大，难以在冷冻电镜下获得清晰结构；而尺寸过小又难以在能量上维持超螺旋构象。

团队与谢菲尔德大学合作，借助高分辨率原子力显微镜在溶液中对DNA小环进行成像，以确定兼顾“可观察性”与“超螺旋稳定性”的最佳尺寸。谢菲尔德大学Royce纳米表征实验室负责人Alice Pyne称，这些小环在超螺旋应力下呈现弯曲的螺旋结构，尺寸小于团队此前能够制备的同类结构。谢菲尔德团队主要作者Sylvia Whittle还开发机器学习工具，用于量化原子力显微镜数据中DNA螺旋结构变化，以比较不同序列与拓扑条件下Cas9行为差异。

研究结果显示，DNA处于超螺旋状态时更容易发生非预期切割。Rueda表示，在相同序列条件下，线性DNA可保持完整而不被Cas9切割，但当DNA处于超螺旋状态时则会被切割。研究人员据此认为，细胞内观察到的部分离靶现象可能不仅与序列有关，也与DNA是否处于超螺旋状态相关。

通过冷冻电镜获得的近原子分辨率结构图像，研究团队观察到Cas9结合超螺旋DNA时会发生几何构型变化，使其更接近“准备切割”的状态：负责切割目标DNA链的HNH结构域向CRISPR切割位点移动。论文提出的解释是，DNA的扭曲与弯曲可能降低解链所需能量，从而降低Cas9结合与切割的能量屏障，进而促进离靶活性。

研究还报告称，超螺旋过程中DNA螺旋的扭曲可能使Cas9更易容忍引导序列与靶DNA之间的序列不匹配。团队表示，传统观点认为不完美匹配通常会阻止Cas9发挥作用，但在超螺旋DNA条件下的结构图像显示了新的不匹配类型，提示可能存在新的离靶切割机制。Rueda称，拓扑结构在不匹配中的作用此前已有迹象，但蛋白质与DNA在分子层面如何相互作用导致这一现象并不清楚，而此次结构结果提供了线索。

研究人员表示，当前多种高保真、低错误CRISPR工具的设计主要依据Cas9与线性DNA相互作用的结构信息；若Cas9在超螺旋DNA上的行为存在系统性差异，相关设计策略可能无法完全反映活细胞内的真实物理条件。Smith认为，新平台与新结构结果为开发“对拓扑结构敏感”的Cas9变体提供了方向。Rueda则表示，研究让团队更接近观察到“真正活跃”的Cas9结构，并为进一步提升编辑准确性提供了基础。

论文同时提到，该项目由跨学科合作推动，除帝国理工与谢菲尔德团队外，还获得MRC LMS冷冻电镜设施及相关研究人员支持。研究团队表示，纳米级超螺旋DNA小环平台未来也可用于研究更广泛的DNA结合蛋白及其他CRISPR系统在真实物理应力条件下的相互作用。